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妊娠中晚期胎羊宫内模拟主动脉瓣球囊成形术实验研究
作者:华益民[1] 
单位:四川大学华西第二医院[1]  
文章号:W037424  
2010/5/27 13:57:08    
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胎儿严重心血管畸形预后差,而孕中、后期干预将改善患胎预后。通过胎儿宫内心脏介入手术(IUCI)可以在一定程度上改善左心发育不良综合征(HLHS)、严重主动脉瓣狭窄(SAS)、室隔完整型肺动脉闭锁(PA/IVS)、严重肺动脉瓣狭窄(SPS)等严重心血管畸形的异常血流,延缓、阻止甚至逆转先天性心血管畸形引起的胎儿水肿、自发性流产或胎儿死亡,促进发育不良的心室重新发育,形成生后的双心室循环,重塑右室流出道梗阻胎儿的肺血管床,提高新生儿的手术耐受力和成功率等,改善患胎预后。目前,临床医师已把关注的目光放到部分罹患严重心血管畸形胎儿的宫内干预上,但这一技术仍处于试验性治疗阶段,尚需要成熟的动物模型支撑,特别是缺乏关于IUCI技术本身对母亲和胎儿会带来何种程度影响的系统研究,IUCI中母亲的安全性如何?对胎儿会有何种程度的负面影响?其所造成的血流动力学改变是否会早场胎儿重要脏器不可逆损伤?本研究通过对妊娠中晚期胎羊模拟宫内主动脉瓣球囊成形术(IUBAV),以探讨手术方法学建立、术中术后孕羊的安全、手术对妊娠结局的影响、胎羊术后创伤和重要脏器组织形态学改变等,为人类胎儿宫内心脏介入手术临床研究建立实验动物模型基础。
    胎儿严重心血管畸形预后差,而孕中、后期干预将改善患胎预后。通过胎儿宫内心脏介入手术(IUCI)可以在一定程度上改善左心发育不良综合征(HLHS)、严重主动脉瓣狭窄(SAS)、室隔完整型肺动脉闭锁(PA/IVS)、严重肺动脉瓣狭窄(SPS)等严重心血管畸形的异常血流,延缓、阻止甚至逆转先天性心血管畸形引起的胎儿水肿、自发性流产或胎儿死亡,促进发育不良的心室重新发育,形成生后的双心室循环,重塑右室流出道梗阻胎儿的肺血管床,提高新生儿的手术耐受力和成功率等,改善患胎预后。目前,临床医师已把关注的目光放到部分罹患严重心血管畸形胎儿的宫内干预上,但这一技术仍处于试验性治疗阶段,尚需要成熟的动物模型支撑,特别是缺乏关于IUCI技术本身对母亲和胎儿会带来何种程度影响的系统研究,IUCI中母亲的安全性如何?对胎儿会有何种程度的负面影响?其所造成的血流动力学改变是否会早场胎儿重要脏器不可逆损伤?本研究通过对妊娠中晚期胎羊模拟宫内主动脉瓣球囊成形术(IUBAV),以探讨手术方法学建立、术中术后孕羊的安全、手术对妊娠结局的影响、胎羊术后创伤和重要脏器组织形态学改变等,为人类胎儿宫内心脏介入手术临床研究建立实验动物模型基础。
 
1 材料与方法
1.1 实验动物及实验方法                                                                
    15只双胎妊娠110~127d (term 150d)黑山羊(四川资阳大业种畜禽养殖场提供),体质量30.5~42.5kg。根据胎羊双顶径(biparietal diameter, BPD)及股骨长径(femur length, FL)判定胎龄。双胎之一为IUBAV组,另一只为对照组,每组15只胎羊。孕羊术前禁食36h,禁饮12h,术前30min肌注阿托品0.03~0.05mg/kg。氯胺酮10mg/kg肌注麻醉,静脉缓慢推注安定0.5~1mg/kg,继以2.5%水合氯醛静脉滴注,35~50gtt/min维持孕羊镇静状态,每小时追加氯胺酮3mg/kg,较强刺激操作前根据情况给予安定0.3~0.5mg/kg静脉推注。麻醉药物通过胎盘循环实现胎羊麻醉。孕羊自主呼吸,吸氧,乳酸林格液补液,腹部备皮,心电监护。超声监测胎羊心率变化情况。
    胎羊IUBAV方法:切开孕羊腹壁暴露部分子宫,并在超声(迈瑞M5型彩色超声仪)引导下选择穿刺部位及适于操作的超声平面,在超声引导下用套管针(由4F止血鞘及18G日本八光株式会社PTC-B穿刺针组成)穿刺IUBAV组胎羊心前区胸壁后进入左心室,成功后立即胎羊心腔内注入肝素100U/ kg(胎羊体质量根据胎龄及BPD估计),继续在超声引导下调整心腔内穿刺针角度对准左室流出道(图1),退出穿刺针针芯,递送0.014 in冠脉导引钢丝,并在超声监测下递送入降主动脉,并沿穿刺针及导引钢丝递送止血鞘内芯及外鞘至心腔内(图2),撤出穿刺针及止血鞘内芯,沿导引钢丝送入5.0~7.0mm×15mm扩张球囊(Nu-Med Lashak球囊))至主动脉瓣环水平,在超声指导下进行球囊扩张2~3次(图3),主动脉血流阻断时间每次约2 s。对照组胎羊同时暴露在手术、麻醉过程中,但不对其进行手术操作。超声监测治疗组及对照组胎羊心率、心律变化情况。从开始麻醉到关腹完成约1.5~2小时。
    术中予孕羊盐酸林可霉素20mg/kg静脉滴注,腹部关闭前予盐酸林可霉素1.2g腹腔内清洗,术后继用盐酸林可霉素10mg/kg.d肌肉注射7天。                                            
        
             

1.2 标本采集及分析 

    以胎羊心腔穿刺成功时刻为起始点T1,介入手术结束时刻为T2,新生羊产后24小时为T3。监测孕羊、胎羊及新生羊心率,IUBAV组胎羊血气、血糖(美国雅培I-STAT 携带式手持血气分析仪)、血乳酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、皮质醇及胰岛素含量。取术后处死胎羊及术后自然分娩新生羊心、脑、肝、肺组织,生理盐水灌流后继用4 %多聚甲醛缓冲液灌注,后用10%中性甲醛固定,梯度酒精脱水,常规石蜡包埋连续切片,均行H&E 染色,肝组织做高碘酸schiff反应(PAS)染色,光镜观察。
    数值变量用x±s 表示,两组数值变量间比较采用成组设计的t 检验,设定 P < 0. 05 为差异有统计学意义。
 
2 结果
2.1 孕羊情况及妊娠结局
    实验过程中孕羊心率波动在106~142 次/min,平均动脉压60~86mmHg(1mmHg = 0.13 kPa),动脉血氧分压90~112mmHg,动脉血氧饱和度95%~98 %,二氧化碳分压32~41mmHg,手术结束时所有孕羊术后存活良好。因需进行短期研究,术后3小时对5只孕羊施行剖腹产取出胎羊进行短期研究,剖腹产后的5只母羊均存活良好,无感染等发生。其余10只孕羊继续怀孕直至分娩,分娩至介入手术时间间隔4~38天,术后妊娠过程顺利,无伤口感染、绒毛膜羊膜炎等发生,6只孕羊早产(60%),4只足月产(40%),均为自然分娩,产后母羊一般情况良好。
2.2  胎羊一般情况 
    均为双胎妊娠,IUBAV组、对照组分别15只胎羊。
    实验过程中,对照组胎羊心率保持在170~200次/min(孕中后期胎羊正常心率140~170次/min);IUBAV组心脏穿刺过程中胎心率均有一过性降低至80~90次/min,9例出现室性早搏,暂停操作后很快恢复,且使用小剂量阿托品(0.01~0.02mg/kg)胎羊心腔内注射后介入操作中的心动过缓明显减轻。IUBAV组胎羊术中出现心包积血12例,手术结束时退穿刺针至心包腔,在超声引导下将积血抽取干净,术后胎羊存活,宫内继续生长。
    胎羊左心室血氧分压58~75mmHg,血氧饱和度80%~88 %,二氧化碳分压39~50mmHg,T1、 T2时点间差异无统计学意义,但随手术进展,胎羊血氧分压有降低趋势,二氧化碳分压有增高趋势,pH 值出现下降,T1 T2 及T3时点间差异有统计学意义( P< 0. 05)。IUBAV组T2胎羊血糖及血乳酸较T1 升高,T3恢复正常,组间差异有统计学意义(P<0.05),见表2。
    IUBAV术后两组胎羊均存活。术后3小时对5只孕羊施行剖腹产,取出两组胎羊各5只进行短期研究。另10只孕羊6只早产,4只足月产。早产新生羊共12只,均表现为毛欠浓密色泽欠佳,蹄质软,精神、活动状态与产时孕龄有关,5只能主动吃奶。足月产新生羊8只,均表现出体质量接近,毛浓密色黑有光泽,蹄质硬,精神、活动状态正常,能主动吃奶,生后6~10小时可站立行走。上述新生羊的外貌特征在IUBAV组及对照组间无明显差异。两组胎羊/新生羊的体质量(body weight, BW)及红细胞压积(hematocrit, Hct)情况见表1,组间差异比较差异无统计学意义(P < 0.05)。
    新生羊在产后24小时被处死,解剖发现IUBAV组胎羊皮肤未见疤痕;切开皮肤后,早产者可见胸壁内侧有直径1~4cm的瘀斑,足月产者胸壁损伤已基本恢复;心脏穿刺点均位于左室心前区,介入手术后7天以后娩出者心尖穿刺部位形成圆凹状疤痕;未发现心包、胸腔感染迹象,无心包粘连现象。
   
表1 胎羊、新生羊BW及Hct情况
 
胎羊(n=5)
早产新生羊(n=6)
足月新生羊(n=4)
IUBAV组
对照组
IUBAV组
对照组
IUBAV组
对照组
BW(kg)
1.87±0.24
1.69±0.31
2.17±0.38
2.32±0.51
2.51±0.39
2.66±0.56
Hct(%)
28.33±4.52
25.68±3.77
33.26±3.51
35.77±6.32
40.19±4.15
41.56±4.33
 
2 胎羊心率、血气值、血乳酸、血糖及电解质变化(x±SD)
 
T2(n=15)
T3(n=10)
HR(Beat/min)
179±28
181±31
139±29
pH﹡
7.29±0.02
7.19±0.05
7.33±0.04
PCO2 (mmHg)
44.70±5. 79
49. 30±6. 19
47.54±7.35
PO2 (mmHg)
63.70±3. 89
61. 30±3.69
69.79±5.42
BGlu(mmol/l)﹡
3.15±1.16
7. 42±2. 88
4.57±1.90
LA (mmol/l) ﹡
3.75±0.45
5.96±0.33
3.38±0.39
K+ (mmol/l)
3.82±0.44
3.99±0.57
3.57±0.75
Na+ (mmol/l)
135.78±16.31
129.59±12.20
138.36±21.76
Cl- (mmol/l)
112.33±8.24
108.33±10.31
115±7.58
Ca++ (mmol/l)
2.37±0.56
2.02±0.48
2.17±0.71
: p<0.05
 
2.3 应激反应情况
    2.3.1 胎羊内分泌激素水平变化
    术后IUBAV组胎羊血肾上腺素、去甲肾上腺素及皮质醇含量明显增加,T1、T2时点比较差异有统计学意义( P <0. 01) ,胎羊血胰岛素含量无明显变化。见表3。
   
胎羊内分泌激素水平变化(x±SD)
 
内分泌激素
T1(n=15)
T2(n=15)
T3(n=10)
IUBAV组
对照组
肾上腺素(pg/ml) ﹡
447.35±79.27
926.45±181.77
561.84±106.53
493.52±178.51
去甲肾上腺素(pg/ml) ﹡
1590.18±155.76
7647.29±559.72
2055.67±331.56
2931.25±523.46
皮质醇(pg/ml) ﹡
48.30±6.77
74.98±11.74
43.77±9.45
51.67±15.23
胰岛素(uU/ml)
4.39±0.86 
4.81±1.41 
3.99±0.79 
4.16±1.25 
﹡: p<0.05 
 
    图4~7
    肝组织PAS 染色(×400倍):④术后对照组胎羊,视野呈浅鲜红色,表明肝脏组织糖原有所消耗; ⑤术后IUBAV组胎羊,肝组织红色减退,以肝静脉窦周围最为明显,表明肝脏组织糖原消耗明显。 
    ⑥⑦对照组及介入组新生羊肝组织PAS 染色,均呈鲜红色,说明通过继续妊娠,胎羊肝糖原已经得到重新积累。             
    2.3.2 胎羊肝脏组织H&E及PAS  
    H&E(hematoxylin and eosin stain):术后立即处死的两组胎羊肝组织内可见少数肝细胞轻度水肿变性,余无异常;新生羊肝组织切片未见异常。
    PAS (periodic acid stain):胎羊心脏介入手术结束时,对照组胎羊肝脏组织PAS 呈鲜红色,表明肝脏组织富含糖原;IUBAV组胎羊肝组织红色减退,以肝静脉窦周围最为明显,表明肝脏组织糖原消耗明显。足月顺产24小时的两组新生羊肝脏组织PAS 均呈鲜红色,IUBAV组与对照组无差别,证实通过继续妊娠,胎羊肝糖原已经得到积累,(见图4~7)。

图4-7
2.4 胎羊心、脑、肺组织病理学检查
    对脏器大体标本0.3~0.5cm厚段切开检查,然后进行切片H&E检查。
    大体标本中,心肌组织、脑组织及肺组织均未发现梗死灶、软化灶及出血灶。心肌组织切片H&E结果显示,IUBAV组穿刺部位心肌及周围组织未见炎性细胞浸润,部分标本可见纤维组织明显增生,提示疤痕形成,两组胎羊及新生羊非穿刺部位心肌均未见明显异常。脑组织切片H&E结果显示,对照组与IUBAV组胎羊及新生羊脑组织内大脑皮质和髓质层次清晰,神经胶质网结构基本正常,未观察到神经元和神经胶质细胞有明显异常的病理性改变。肺组织切片H&E显示两组胎羊/新生羊在肺泡大小、数量及肺泡间质等方面均无明显差异。   
 
3 讨论
    关于严重先天性心血管畸形的宫内介入干预,目前已经有多个医学中心在临床开展并取得了一定的临床效果],但多为病例报道报道,且仅有少许关于宫内心脏介入术后胎儿血流动力学变化的研究。就我们所知,目前对宫内介入治疗这一技术本身对母胎带来的影响没有系统的研究报道,仅有的相关报道是在胎羊模型上研究胎儿镜操作技术技术可行性、心脏介入操作对鸡胚胎生长发育的影响等。为了能够系统、全面地了解宫内介入治疗技术及其对术后母胎的影响,我们在胎羊模型上模拟IUBAV进行相关研究,以为人类严重心血管畸形宫内介入治疗临床实践提供借鉴。
    我们的第一关注点是母亲的安全,这是产前干预的最高伦理学原则。研究中,15只孕羊在IUBAV结束时均存活良好。术后妊娠过程顺利,无伤口感染、绒毛膜羊膜炎等发生,均为自然分娩。因实验需要剖腹产的母羊和继续怀孕分娩后的母羊均一般情况良好。证明我们所采取的治疗方式对母亲来讲是安全的,因而具有了可行性。
    研究中我们采用切开孕羊腹壁暴露部分子宫,超声引导下进行胎羊心脏介入手术。术中孕羊子宫外置、胎羊心脏穿刺及主动脉血流阻断等刺激都可导致胎羊应激反应。术中监测数据显示胎羊血气指标尚能保持稳定,但出现了儿茶酚胺及皮质醇水平上升,PH值降低及血乳酸增加,说明应激反应已经在一定程度上影响到了胎羊胎盘功能,会对胎羊术后恢复及宫内继续妊娠会产生一定程度的不良影响。有研究表明胎盘血管对儿茶酚胺敏感性强,儿茶酚胺增加可引起胎盘血管阻力增高、血流减少,影响胎盘气体交换功能[23-25] 。虽然这些变化在我们的研究中不可避免地发生了,但令人鼓舞的是孕羊妊娠结局、足月新生羊血糖水平正常及术后肝糖原得到重新积累提示胎羊心脏模拟介入手术中胎羊应激反应程度所导致的器官病理变化可能是可逆性的,两组胎羊及新生羊重要脏器病理检查均无明显异常,并且研究资料表明两组胎羊/新生羊的体质量及红细胞压积的差异没有统计学意义,提示宫内心脏介入手术没有造成胎羊失血过多及生长发育障碍。尽管有上述相对理想的结果,我们仍应当在手术过程中针对这些变化采取一定的干预措施,如吸氧改善氧供、使用皮质激素抑制胎羊应激反应、运用吲哚美辛改善胎盘胎羊血供等,这对提高实验的整体成功率非常重要。
    White等研究认为,胎儿痛觉已经发育,疼痛刺激会导致胎儿产生应激反应。在我们进行胎羊心脏介入手术过程中,经腹超声监测下,我们观察到当穿刺针碰触到胎羊肢体时胎羊有肢体移动的躲避反应,穿刺胎羊胸壁时,胎羊会出现踢弹、挣扎等动作,胎动、心率明显增加,这些都提示胎羊对疼痛等刺激存在应激反应,与人类胎儿相似。
    如何解决宫内手术过程中及术后子宫收缩和预防感染,是胎儿外科治疗成功与否的一个关键因素,因为一旦发生早产和影响妊娠结局的感染,胎儿期手术就变得毫无意义。子宫和羊膜腔的完整性一旦受到破坏,早产则难以避免。我们的研究中采取了介入手术这一微创治疗方式,它对子宫和羊膜腔的创伤最小,发生感染机会少,术后能够保证胎羊在母体子宫内正常生长至足月分娩,且在未使用子宫收缩抑制剂及其他干预措施的情况下,术后孕羊40%足月分娩。此外,非心脏胎儿外科术后常有羊水渗漏,羊水过少可导致胎肺发育不全或脐带受压影响胎儿血液供应。本实验中,我们观察到术中子宫穿刺点无明显羊水溢出,术后超声检测显示孕羊无腹腔积液,子宫内羊水无减少趋势,胎羊能够顺利生长发育,娩出后新生羊治疗组和对照组之间体质量、血红蛋白无明显差异,肺组织切片显示两组在肺泡大小、数量及肺泡间质等方面均无明显差异,确证了这一实验性治疗手段的安全性。此外,皮质醇在胎儿分娩发动过程中起重要作用,在胎羊实验中亦有类似发现[28-30]。因此,我们推测胎羊心脏介入手术时由于应激反应导致的肾上腺皮质分泌的过多皮质醇可能对胎羊宫内继续妊娠是不利因素,同时胎羊应激激素水平改变亦不利于胎羊宫内存活,我们实验中术后孕羊有较高的的早产率(60%)可能与这些因素有关,并值得我们进一步关注与研究。
    本研究结果表明,妊娠羊经子宫胎羊心脏介入手术后能够继续妊娠并经阴道自然分娩,新生羊行为和组织病理学结果证实,利用妊娠晚期胎羊进行胎儿心脏介入手术研究是可行的,我们能够利用这一动物模型进行各相关影响因素的深入研究及探讨,建立成熟可行的人类IUCI方案,为严重心血管畸形(HLHS、SAS、PA/IVS、SPS)患胎及其家庭带来希望。  
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作者简介
华益民
单位:四川大学华西第二医院
简介:华益民教授/主任医师,四川大学华西第二医院儿童心血管疾病介入诊疗中心主任,卫生部儿童先天性心脏病专家
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